NY_T 2837-2015 蜜蜂瓦螨鉴定方法
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.57 |
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9 |
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日期： |
2024-8-14 |
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ICS 65.140,B47 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2837—2015,蜜蜂瓦螭鉴定方法,Identification of Varroa from honey bees,201570-09 发布2015-12-01 实施,中华人民共和国农业部发布,NY/T 2837—2015,* * —1-,刖 a,本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草,本标准参考了世界动物卫生组织（。正）制定的《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012版）,本标准由农业部兽医局归口,本标准起草单位:中国农业科学院蜜蜂研究所,本标准主要起草人:周婷、王强、代平礼、吴艳艳、周玮、徐书法、王星、段俊明、黄智勇,I,ny/t 2837—2015,蜜蜂瓦螭鉴定方法,范围,本标准规定了蜜蜂主要体外寄生瓦蛾鉴定方法,本标准适用于蜜蜂瓦蛾--- 狄斯瓦螭（.Varroa destructor ） 雅氏瓦螭（V. Jacobso疝）、林氏瓦蜻,（V.み"dereri）和恩氏瓦蛾"”""erwoo由）的鉴定,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,NY/T 1954蜜蜂螭病病原检查技术规范,SN/T 1684瓦螭病诊断方法,3试剂、材料和仪器,见附录A,4瓦蜻的分离方法,4. I碎屑分离法,4. 1. 1随机分离法,将包有铁纱网的薄铁板置于蜂箱底部,通常1 d.2 d内产生的碎屑中可见少量的瓦蜻,4. 1.2药物分离法,按照NY/T 1954的规定执行,4.2封盖子分离法,用刀割去封盖子脾的房盖,再将温水喷淋巢脾,下面放置双层网筛,抖出巢房内的大幼虫或蜂蛹,使,蜜蜂大幼虫和蜂蛹留在上层粗网筛上（孔径2. 2 mm）,而瓦螭落在下层细网筛中（孔径1 mm）?,4.3成年蜜蜂糖粉或面粉分离法,将蜜蜂抖落于大漏斗内,利用500 mL或1 000 mL容量的广ロ瓶收集大漏斗内的蜜蜂,约占瓶容量,的1/3。取10g 80目的细糖粉或面粉倒入装有蜜蜂的广口瓶中,瓶口用3mm孔径铁纱网封严;将广口,瓶横置放于平面上来回滚动3 min,使糖粉或面粉均匀黏附至每只蜜蜂体上。将广ロ瓶瓶口朝下剧烈振,荡,使糖粉或面粉及瓦螭振落于光滑白纸上,再分离收集掉落的瓦蛾〇,5瓦螭的鉴定方法,5.1 形态学鉴定,利用体视解剖镜观察并记录瓦蛾的大小、形状、背板颜色、胸板、生殖腹板、肛板、腹侧板和后足板形,状,刚毛对数和足等的形态特征,5.2 分子生物学鉴定,5. 2. 1样本采集,按照第4章的分离方法取得瓦螭,并将瓦螭浸于70%乙醇溶液中,一20℃保存,NY/T 2837—2015,5.2.2总DNA简易提取法,单个瓦螭用无菌水洗涤,吸水纸吸干表面;将瓦螭置于1. 5 mL离心管内,加入40戸12义WLB缓冲,液(其中,蛋白酶K终浓度50 kg/mL)后进行研磨,50℃孵育1 h；100℃煮沸10 min.15 min,冷却至室,温,加入40ル超纯水,1 000 g离心5 s备用,5. 2. 3 PCR扩增瓦螭mtDNACO-I基因片段,5. 2. 3. 1引物序列,上游引物:5 J GGAGGAGATCCAATTCTATATCAAC - 3'；,下游引物:5CCTGTTATAATAGCAAATAC - 3' ；,预期扩增产物为458 bp,5. 2. 3. 2 PCR扩增体系,PCR扩增体系总体积为,总DNA提取液,上、下游引物,Taq酶,10 X buffer,lOXdNTP(各 2. 5 mmol/ L),超纯水,50戸L,10匹,各1ル,0. 5 ptL,5戸1ノ,1 rL,31.5mL,5. 2. 3. 3 PCR 程序,94℃,94℃,50℃,72℃,72℃,4℃,5 min,60 s ],75 s [义30个循环,90 s ],5 min,oo,5.2. 3.4 PCR扩增产物凝胶电泳检测,1. 2%琼脂糖凝胶配制方法见附录A. 1.3；5 扩增产物加1ル上样缓冲液(6XDNA Loading,Buffer),DNA Marker 1(0. 05 mg DNA/mL)用量 4 ML0 120 V,30 min;凝胶成像仪观察,并记录分析;,阳性PCR产物送测序公司进行序列测定,5.2.4瓦螭mtDNA CO !基因限制性内切酶反应体系,5. 2. 4. 1 Sac !限制性内切酶消化体系,37℃水浴2 h,l. 2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果,电泳及凝胶成像方法参见5. 2. 3. 4,5. 2. 4.2 Xho I限制性内切酶消化体系,Buffer L,Sac I,PCR产物,超纯水,2戸L,1 JltL,7丛L,8戸L,37℃水浴2 h,l. 2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果,电泳及凝胶成像方法参见5. 2. 3. 4,Buffer H,Xho I,PCR产物,超纯水,2俨L,1廿1ノ,7,8 ptL,2,NY/T 2837—2015,6结果判定,6. 1形态学鉴定,狄斯瓦螭形态学鉴定按照SN/T 1684和NY/T 1954 （见图1）;雅氏瓦螭（体长平均1 063. 0,宽1 506. 8 f/m）与狄斯瓦螭（体长平均! 167. 3ゆ,宽1 708. 9 pim）形态相似,但前者比后者的体型偏小,而且更接近圆形（见图1和图2）;林氏瓦螭（体长平均1 180宽1 698 ；zm）与狄斯瓦螭相似,胸板上的,刚毛和隙孔数目较少,气管长且弯曲度较大,须肢转节无刚毛,而其他3……
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